超凈工作臺在纖維細胞生物學(xué)實(shí)驗的使用

近年來(lái)，隨著(zhù)組織工程及再生醫學(xué)的迅猛進(jìn)展脂肪干細胞鑒于其取卡材便利，來(lái)源豐富，低免疫性及多分化潛能等諸多優(yōu)點(diǎn)，已成為人們研究的熱門(mén)。但以往的研究大多集中在A(yíng)DSCs多分化潛能在組織工程和再生醫學(xué)中的應用，很少關(guān)照ADSCs分泌功能在組織損傷修復中的作用。本實(shí)驗通過(guò)使用超凈工作臺并觀(guān)測研究了ADSCs分泌功能對成纖維細胞的生物學(xué)影響，探討ADSCs分泌功能促創(chuàng )面愈合的機制。

材料和方法

1 主要儀器與試劑：DMEM培養液、胰酶、I型膠原酶、二甲基亞砜、MTT、小牛血清，胎牛血清，annexinV凋亡檢測試劑盒，Mondel680型酶標儀，垂直流超凈工作臺，CO2細胞培養箱，顛倒顯微鏡，流式細胞儀。

2 ADSCs分離與培養：取腹部外科手術(shù)患者皮下脂肪組織約59，無(wú)菌條件下用剪刀剔除血管及其它組織碎片，用含雙抗的PBS液反復浸泡沖洗3次，每次約5min，用眼科剪將脂肪組織剪成約lmm3的碎塊，置于0．1％的I型膠原酶中于37℃水浴振蕩消化1h；加入等體積l0％胎牛血清精細消化后，用200目的細胞篩網(wǎng)過(guò)濾，600g離心lOmin，棄去上層脂肪及上清液，沉淀用含l0%胎牛血清培養液重懸接種于培養瓶，置于37℃、5％的C02培養箱中陳規培養。2天后換液，細胞長(cháng)滿(mǎn)80％時(shí)傳代培養。

3 3ADSCs培養上清液的制備：選擇生長(cháng)良好第3代．ADSCs細胞接種于75cm2的培養瓶，生長(cháng)**80％融合時(shí)，換成尢血清培養液DMEM15ml，培養3天后，搜集上清液。上清液經(jīng)O．22μm的濾膜過(guò)濾．分裝，一80。C凍存備用。

4 人皮膚成纖維細胞的培養：用組織塊法培養原代細胞，置于10％小牛血清培養液中，置于37℃、5％C02培養箱中陳規培養。

5 成纖維細胞增殖的測定：采納MTT法測定。傳代時(shí)取第3代成纖維細胞以3×10／孔接種于12孔板，陳規培養24h后棄上清，設實(shí)驗組及對比組，實(shí)驗組均用ADSC-CM及2％小牛血清配制，對比組僅用2％小牛血清培養液，每組設3個(gè)復孔。各組加對應的培養液lml，連續培養3天后，每孔分別加入5g／L的MTT100μl，37℃、5％C02孵育4h后，精細培養：吸棄上清液，每孔加入750μl。二甲基亞楓，連續孵育lOmin后稍微振蕩使紫藍色沉淀融解，然后以150μl／孔移動(dòng)**96孔板，每孔反復5次。用酶標儀測定490nm波長(cháng)下的吸光度值。