1、環(huán)境要清潔，進(jìn)行無(wú)菌操作前半小時(shí)，須停止清掃地面等工作。避免不必要的人群流動(dòng)，防止塵埃飛揚。治療室應每天用紫外線(xiàn)消毒一次。
2、進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，衣帽穿戴要整潔。帽子要把全部頭發(fā)遮蓋，口罩須遮住口鼻，并修剪指甲、洗手。
3、無(wú)菌物品與非無(wú)菌物品應分別放置。無(wú)菌物品不可暴露在空氣中，必須放于無(wú)菌包或無(wú)菌容器內，無(wú)菌物品一經(jīng)使用后，必須再經(jīng)滅菌處理后方可使用。從無(wú)菌容器中取出的無(wú)菌物品，雖未使用，也不可放回無(wú)菌容器內。
4、無(wú)菌包應注明物品的名稱(chēng)、消毒滅菌日期，并按日期先后順序排放，以便取用，放在固定的地方。無(wú)菌包在未污染的情況下，可保存7-14天，過(guò)期應重新滅菌。 5、取無(wú)菌物品時(shí)，必須用無(wú)菌持物鉗（鑷）。未經(jīng)消毒的用物不可觸及無(wú)菌物或跨越無(wú)菌區。
6、進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，應更換或重新滅菌。
7、一份無(wú)菌物品，只能供一個(gè)病員使用，以免發(fā)生交叉感染。 無(wú)菌操作注意事項：
1. 實(shí)驗進(jìn)行前，無(wú)菌室及
無(wú)菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面，并開(kāi)啟
無(wú)菌操作臺風(fēng)扇運轉10 分鐘后，才開(kāi)始實(shí)驗操作。每 次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間 污染。實(shí)驗完畢后，將實(shí)驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無(wú)菌操作抬面。操作間 隔應讓
無(wú)菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細胞株之操作。
2. 無(wú)菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可
以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗用品以70 % ethanol 擦 拭后才帶入無(wú)菌操作臺內。實(shí)驗操作應在抬面之中央無(wú)菌區域，勿在邊緣之非無(wú)菌區域操 作。
3. 小心取用無(wú)菌之實(shí)驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打
開(kāi)之容器正上方操作實(shí)驗。容器打開(kāi)后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用， 盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗。對于來(lái)自人類(lèi)或是病
毒
感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無(wú)菌操作臺(**少Class II)。操作過(guò)程 中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。 5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力
5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤(pán)是否有污染(水盤(pán)的水用無(wú)菌水，每周更換)。 5.3. 無(wú)菌操作臺內之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線(xiàn)燈管及HEPA 過(guò)濾膜，預濾網(wǎng)(300 小時(shí)/預濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水 植物外植體消毒和接種：
用于進(jìn)行組織培養的組織、器官和細胞稱(chēng)為外植體。在組織培養中，外植體如果是帶菌的，在接種前都必須進(jìn)行表面消毒，這是取得培養成功的**基本的和重要的前提。常用消毒劑對外植體進(jìn)行消毒。從室外取的材料，一般先用自來(lái)水沖洗數分鐘，對表面不光滑或長(cháng)有絨毛等結構不容易洗凈的材料，自來(lái)水沖洗的時(shí)間要長(cháng)，幾個(gè)小時(shí)或過(guò)夜，并且用洗衣粉或洗潔精洗滌，必要時(shí)用毛刷刷洗。洗后的材料用濾紙擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接種材料使用消毒劑后，要用無(wú)菌水洗滌3～5 遍，**后用無(wú)菌紙擦干凈。使用消毒劑的原則是既要達到消毒目的，又不能損傷植物組織和細胞，還要符合就地取材的原則。對一些容易污染、較難滅菌的外植體進(jìn)行表面消毒時(shí)，用單一消毒劑不能收到好的效果，所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。一般，shou先用75％乙醇浸泡外植體數秒鐘**30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸鈉溶液5～30min，然后用無(wú)菌水洗滌。有時(shí)在氯化汞或次氯酸鈉滅菌后，用無(wú)菌水洗，進(jìn)一步剝去幾層組織或器官如葉片后，再用次氯酸鈉滅菌3～5min，無(wú)菌水漂洗3 次后，切割、用于接種。
用消毒劑對接種材料進(jìn)行滅菌處理時(shí)，可以在滅菌溶液中加入1～2 滴表面活性劑，如吐溫80或吐溫20，它們可以濕潤外植體整個(gè)組織，促進(jìn)滅菌液充分接觸表面組織，達到較好的消毒效果。有時(shí)還可以用磁力攪拌、超聲振動(dòng)等方法使消毒殺菌劑進(jìn)入外植體。消毒溶液對外植體消毒是在
超凈工作臺上進(jìn)行。完成表面消毒的接種材料要盡快放置于培養基中。
植物外植體消毒和接種(以胡蘿卜為例)：
1 ．接種前，用75 ％乙醇棉球或用2％苯扎溴銨溶液擦拭
超凈工作臺臺面，將培養基及用具放入工作臺，開(kāi)
超凈工作臺紫外燈照射**少20 min，然后開(kāi)送風(fēng)開(kāi)關(guān)，之后關(guān)閉紫外燈，通風(fēng)10 min后，再開(kāi)日光燈進(jìn)行無(wú)菌操作。
2 ．將胡蘿卜塊根在自來(lái)水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織，切成小塊分別放100 mL 燒杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分別浸泡2 、5 、10 min ，用無(wú)菌水洗滌3 次，無(wú)菌紙吸干水分。取出培養皿，剪刀和鑷子使用前插入90％乙醇溶液中，使用鑷子時(shí)在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后，切取髓部組織0.5cm 。以上操作都要在試管口靠近火焰旁。#p#分頁(yè)標題#e#3 ．將培養容器斜面向上，并使它們拉于水平位置，也可將培養容器放在左手中。將塞蓋用右手擰轉松動(dòng)，以便接種時(shí)拔出。用火焰灼燒管口，灼燒時(shí)應不斷轉動(dòng)試管口（靠手腕的動(dòng)作，使試管口沾染的少量菌得以燒死）。將燒過(guò)的接種針（環(huán)）觸動(dòng)培養基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后輕輕接觸外植體，慢慢將接種針（環(huán)）抽出試管，打開(kāi)培養容器蓋，將外植體放在培養基上，每瓶放3 塊。封口，貼標簽，注明姓名，標明時(shí)間和材料名稱(chēng)。整理好接種室（箱）的臺面，搞好清潔衛生。
4 ．用水洗干凈非洲澎蜞菊葉片，用濾紙擦干后置于100 mL 燒杯中，在超凈工作臺上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液浸泡3 、5 、7 min，用無(wú)菌水洗滌3 次，將葉片切成長(cháng)1cm ,按照上述同樣的步驟接種于培養基上。
5 ．綠豆種子用75％乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1％氯化汞溶液（加入吐溫2 滴）浸泡3 、5 、10 min ，期間不斷攪拌溶液，用無(wú)菌水洗滌5～6 遍，洗干種子外圍水分，按照上述同樣的步驟接種于培養基上。
無(wú)菌操作原則：
一、在執行無(wú)菌操作時(shí)，必須明確物品的無(wú)菌區和非無(wú)菌區。
二、執行無(wú)菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。 三、夾取無(wú)菌物品，必須使用無(wú)菌持物鉗。 [無(wú)菌操作間]
無(wú)菌操作間
四、進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無(wú)菌物品或超過(guò)無(wú)菌區取物。 五、無(wú)菌物品必須保存在無(wú)菌包或滅菌容器內，不可暴露在空氣中過(guò)久。無(wú)菌物與非無(wú)菌物應分別放置。無(wú)菌包一經(jīng)打開(kāi)即不能視為**無(wú)菌，應盡早使用。凡已取出的無(wú)菌物品雖未使用也不可再放回無(wú)菌容器內。
六、無(wú)菌包應按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開(kāi)放置，并經(jīng)常檢查無(wú)菌包或容器是否過(guò)期，其中用物是否適量。
七、無(wú)菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過(guò)滿(mǎn)，以免取用時(shí)碰在容器外面被污染。
原則及注意事項
無(wú)菌操作原則：
一、在執行無(wú)菌操作時(shí)，必須明確物品的無(wú)菌區和非無(wú)菌區。 二、執行無(wú)菌操作前，先戴帽子、口罩、洗手，并將手擦干，注意空氣和環(huán)境清潔。 三、夾取無(wú)菌物品必須使用無(wú)菌持物鉗。
無(wú)菌操作間
四、進(jìn)行無(wú)菌操作時(shí)，凡未經(jīng)消毒的手、臂、均不可直接接觸無(wú)菌物品或超過(guò)無(wú)菌區取物。 五、無(wú)菌物品必須保存在無(wú)菌包或滅菌容器內，不可暴露在空氣中過(guò)久。無(wú)菌物與非無(wú)菌物應分別放置。無(wú)菌包一經(jīng)打開(kāi)即不能視為**無(wú)菌，應盡早使用。凡已取出的無(wú)菌物品雖未使用也不可再放回無(wú)菌容器內。 六、無(wú)菌包應按消毒日期順序放置在固定的柜櫥內，并保持清潔干燥，與非滅菌包分開(kāi)放置，并經(jīng)常檢查無(wú)菌包或容器是否過(guò)期，其中用物是否適量。 七、無(wú)菌鹽水及酒精、新潔爾滅棉球罐每周消毒一次，容器內敷料如干棉球、紗布塊等，不可裝得過(guò)滿(mǎn)，以免取用時(shí)碰在容器外面被污染。
無(wú)菌操作技術(shù)及注意事項
1、玻璃器皿的消毒和清潔 ⑴新購玻璃器皿的處理新購玻璃器皿應用熱肥皂水洗刷，流水沖洗，再用1%～2%鹽酸溶液浸泡，以除去游離堿，再用水沖洗。對容量較大的器皿如試劑瓶、燒瓶或量具等，經(jīng)清水洗凈后應注入濃鹽酸少許，慢慢轉動(dòng)，使鹽酸布滿(mǎn)容器內壁數分鐘后傾出鹽酸，再用水沖洗。 ⑵污染玻璃器皿的處理 ①一般試管或容器可用3%煤酚皂溶液或5%石炭酸浸泡，再煮沸30分鐘，或在3%～5%漂白粉澄清液內4小時(shí)，有的亦可用肥皂或合成洗滌劑洗刷使盡量產(chǎn)生泡沫，然后用清水沖洗**無(wú)肥皂為止。**后用少量蒸餾水沖洗。 ②細菌培養用的試管和培養皿可先行集中，用1kg/cm2高壓滅菌15～30分鐘，再用熱水洗滌后，用肥皂洗刷，流水沖洗。 ③吸管使用后應集中于3%煤酚皂溶液中浸泡24小時(shí)，逐支用流水反復沖洗，再用蒸餾水沖洗。 ④油蠟沾污的器皿，應單獨滅菌洗滌，先將沾有油污的物質(zhì)棄去，倒置于吸水紙上，100℃烘干半小時(shí)，再用堿水煮沸，肥皂洗滌，流水沖洗。必要時(shí)可用二甲苯或汽油去油污。 ⑤染料沾污的器皿，可先用水沖洗，后用清潔或稀鹽酸洗脫染料，再用清水沖洗。一般染色劑呈堿性，所以不宜用肥皂的堿水洗滌。 ⑥玻片可置于3%煤酚皂溶液中浸泡，取出后流水沖洗，再用肥皂或弱堿性煮沸，自然冷卻后，流水沖洗。被結核桿菌污染或不易洗凈的玻片，可置于清潔液內浸泡后再沖洗。 2、無(wú)菌器材和液體的準備將玻璃器具中的培養皿、培養瓶、試管、吸管等按上述方法洗凈烘干后，用一潔凈紙包好瓶口并把吸管尾端塞上棉花，裝入干凈的鋁盒或鐵盒中，于120℃的干燥箱中干燥滅菌2小時(shí)，取出備用。對于手術(shù)器械、瓶塞、工作服以及新配制的PBS洗液，則采用高壓蒸氣滅菌法，即在15磅的條件下，加熱20分鐘。而對于MEM培養液、小牛血清和消化液等需用G5或G6濾器負壓抽濾后使用。 3、無(wú)菌操作過(guò)程在無(wú)菌操作過(guò)程中，**重要的是要保持工作區的無(wú)菌、清潔。因此，在操作前20～30分鐘要先啟動(dòng)
超凈臺和紫外燈，并認真洗手和消毒。在操作時(shí)，嚴禁喧嘩，嚴禁用手直接拿無(wú)菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的止血鉗、鑷子等。培養瓶應在
超凈臺內操作，并且在開(kāi)啟和加蓋瓶塞時(shí)需反復用酒精燈燒。對于吸管應先用手拿后1/3處，戴上膠皮乳頭，并用酒精燈燒烤之后再吸液體。 4、常用清潔液的配制法⑴重鉻酸鉀清潔液：可根據不同需要，選用下列的任何一種濃度。先將重鉻酸鉀溶于水中，再慢慢加入濃硫酸。注意，此#p#分頁(yè)標題#e#
時(shí)可產(chǎn)生高熱，應防止容器破裂。重鉻酸鉀清潔液除污力強，腐蝕性大，應避免接觸皮膚和衣服。為防止吸收空氣的水分而變質(zhì)，此液應貯存于帶蓋的容器中。如清潔效力較差，可再加入少量重鉻酸鉀及濃硫酸，還可繼續使用。直到液體變藍綠色，即不能再用。配制重鉻酸鉀清潔液時(shí)，宜用耐高溫的陶瓷缸或耐酸搪瓷或塑料容器。使用玻璃器皿時(shí)，應特別注意防止產(chǎn)生高熱而破裂，切忌用量筒來(lái)配制。 ⑵磷酸三鈉將其配成5%～10%水溶液，可用于洗滌玻璃器皿上的油污，但經(jīng)常使用腐蝕玻璃，使器皿表面模糊、毛糙。 ⑶硝酸清潔液將其配成50%水溶液，可用于清潔微量滴定筒。⑷乙二胺四乙酸二鈉（EDTA鈉鹽）將其配成5%～10%水溶液，可洗脫粘附于玻璃器皿內壁的白色沉淀物。⑸尿素溶液尿素是溶解蛋白質(zhì)的良好溶劑，適用于洗滌粘附有血液血清等蛋白質(zhì)的吸管、試管等。
無(wú)菌操作法
2007-10-24 17:23 【大 中 小】【我要糾錯】 無(wú)菌操作法，是整個(gè)過(guò)程控制在無(wú)菌條件下進(jìn)行的一種操作方法。某些藥品加熱滅菌后發(fā)生變質(zhì)、變色或降低含量者可采用無(wú)菌操作法制備。此種無(wú)菌操作，不僅用于注射劑而且對其它的如滴眼劑、海棉劑等用于粘膜和創(chuàng )傷的制劑也均適用。無(wú)菌操作室或無(wú)菌操作所用的一切用具、材料以及環(huán)境，均須應用面所述滅菌法滅菌，操作須在無(wú)菌操作室或無(wú)操作柜內進(jìn)行。
（一）無(wú)菌操作的空氣滅菌可應用上節《氣體滅菌法》中所述的甲醛、丙二醇、乳酸、三甘醇等。其具體用法不再贅述。藥廠(chǎng)大型無(wú)菌操作，常用甲醛溶液加熱熏蒸進(jìn)行空氣滅菌。將甲醛溶液放入瓶?jì)?，逐漸被吸收蒸氣夾層加熱鍋中，甲醛溶液被加熱，甲醛蒸氣經(jīng)氣出口送入總進(jìn)風(fēng)道，由鼓風(fēng)機吹入無(wú)菌操作室，連續3小時(shí)后，一般即可將鼓風(fēng)機關(guān)閉。室溫應保持25℃以上，以免室溫過(guò)低甲醛蒸氯了聚合而附著(zhù)于冷表面，濕度應保持60％以上，密閉熏蒸12－24小時(shí)以后，再將25％氨水加熱（每m3用8－10ml），從總風(fēng)道送入氨氣約15分鐘，以吸收甲醛蒸氣，然后開(kāi)啟總出口排風(fēng)，并通入經(jīng)處理過(guò)的無(wú)菌空氣直到室內無(wú)臭氣為止。 除用上述方法定期進(jìn)行較徹底的滅菌外，還要對室內的空間、用具（桌椅等）、地面、墻壁等，用3％酚溶液、2％煤酚皂溶液、0.2%新潔而或75％酒精噴灑或擦試。其它用具盡量用熱壓滅菌法或干熱滅菌法滅菌。每天工作前開(kāi)啟外線(xiàn)一小時(shí)，中午休息時(shí)間也要開(kāi)1／2－1小時(shí)。
（二）無(wú)菌操作操作人員進(jìn)入操作之前要洗澡并換上已經(jīng)滅菌的工作服和清潔的鞋子，不使頭發(fā)、內衣等露出來(lái)，以免造成污染機會(huì )。安瓿要150－180℃2－3小時(shí)干熱滅菌。橡皮塞要以121℃1小時(shí)熱壓滅菌。有關(guān)器具、機器都要經(jīng)過(guò)滅菌。用無(wú)菌操作法制備的注射劑， 大多要加入抑制。醫學(xué)教育網(wǎng)搜集整理 小量無(wú)菌制劑的制備，也可在無(wú)菌操作柜中進(jìn)行。無(wú)菌操作柜分小型無(wú)菌操作與聯(lián)合無(wú)菌無(wú)操作兩種小型無(wú)菌操作柜又稱(chēng)單人無(wú)菌柜。式樣有單面式與雙面式兩種。操作柜的架子用木制，四周配以玻璃，前面操作下裝木板，挖二圓孔，孔內密接橡皮手套或袖套。藥品及用具等，由側門(mén)送入柜內后關(guān)閉。操作時(shí)可完全與外界空氣隔jue。柜內空氣的滅菌，可在柜中央上方裝一小型紫外線(xiàn)燈，使用前1小時(shí)啟燈滅菌，或用藥液（如3％酚溶液）噴霧滅菌。聯(lián)合無(wú)菌操作柜是由幾個(gè)小型操作柜聯(lián)合制成，以使原料的精制，傳遞分裝及成品暫時(shí)存放等工作全部在柜內進(jìn)行。近年來(lái)，采用層流
潔凈工作臺作無(wú)菌操作，使用方便，效果可靠。
意義
無(wú)菌是指在環(huán)境中一切有生命活動(dòng)的微生物的營(yíng)養細胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態(tài)。在微生物實(shí)驗中， 操作的目的在于防止待接種細菌被雜菌污染。只有在培養基、實(shí)驗器皿等處于無(wú)菌的前提下，才能保證菌種不被污染。 接種細菌時(shí)，應注意以下幾項：
（1）在超凈工作臺上操作，工作臺在使用前要紫外消毒，酒精消毒等 （2）應在酒精燈火焰前操作
（3) 取菌種前灼燒接種針或接種環(huán)（要燒紅）
（4）燒紅的接種針（環(huán)）稍事冷卻再取菌種，以免燒死菌種 （5）接種后應盡快塞上棉塞
總之，一句話(huà)，盡可能防止雜菌污染?。。?！
